本发明开发出一种在试管内由采集的血细胞使NK细胞扩增来制备细胞疗法的最佳数量的NK细胞的技术。本发明提供一种NK细胞的扩增方法。本发明的NK细胞的扩增方法包括：制备包含NK细胞的细胞群的步骤；从所述包含NK细胞的细胞群中将T细胞除去的步骤；和在包含2500IU/mL至2813IU/mL的IL-2的培养基中培养除去了所述T细胞后的剩余的细胞的步骤。有时本发明的NK细胞的扩增方法包括，从所述包含NK细胞的细胞群中将造血前体细胞除去的步骤。本发明提供一种用于细胞疗法的医药组合物，其包含通过本发明的NK细胞的扩增方法而制备的NK细胞。有时本发明的用于细胞疗法的医药组合物用于治疗传染病和/或癌症。
1.一种NK细胞的扩增方法，其特征在于，包括：制备包含NK细胞的细胞群的步骤；从所述包含NK细胞的细胞群中将T细胞除去的步骤；和在包含2500IU/mL至2813IU/mL的IL-2的培养基中培养除去了所述T细胞后的剩余的细胞的步骤。
2.根据权利要求1所述的NK细胞的扩增方法，其特征在于，从所述包含NK细胞的细胞群中将所述T细胞除去的步骤是通过将CD3阳性细胞除去的步骤来实现的。
3.根据权利要求1或2所述的NK细胞的扩增方法，其特征在于，包括从所述包含NK细胞的细胞群中将造血前体细胞除去的步骤。
4.根据权利要求3所述的NK细胞的扩增方法，其特征在于，从所述包含NK细胞的细胞群中将所述造血前体细胞除去的步骤是通过将CD34阳性细胞除去的步骤来实现的。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的NK细胞的扩增方法，其特征在于，所述培养基包含自体血清、AB型血清和/或血清白蛋白。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的NK细胞的扩增方法，其特征在于，制备所述包含NK细胞的细胞群的步骤是通过从采集自受试者的血细胞中将单核细胞分离的步骤来实现的。
7.根据权利要求6所述的NK细胞的扩增方法，其特征在于，所述血细胞采集自外周血、脐带血、骨髓和/或淋巴结。
8.根据权利要求7所述的NK细胞的扩增方法，其特征在于，通过血液成分单采术从外周血采集所述血细胞。
9.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其特征在于，所述包含NK细胞的细胞群由选自源于干细胞的造血干细胞、源于脐带血的造血干细胞、源于外周血的造血干细胞、源于骨髓血的造血干细胞、脐带血单核细胞、和外周血单核细胞中的至少1种细胞来制备，其中所述干细胞为选自胚胎干细胞、成体干细胞及人工多能干（iPS）细胞中的任意一种。
10.一种用于细胞疗法的医药组合物，其特征在于，包含通过权利要求1至9中任一项所述的扩增方法而制备的NK细胞。
11.根据权利要求10所述的医药组合物，其特征在于，用于治疗传染病和/或癌症。技术领域
本发明涉及可以高纯度及高扩增倍率来扩增具有高溶细胞活性（細胞傷害活性）的自然杀伤细胞（NK细胞）的方法、和包含通过该方法而得到的NK细胞的医药组合物。
背景技术
NK细胞并不攻击表达MHC类I型分子的正常细胞，而主要攻击MHC类I型分子的表达降低及缺损的细胞。因此，如果在癌症及传染病的细胞疗法使用该种NK细胞，则具有可以回避GVH（Graft-versus-host，移植物抗宿主）病的副作用的优点。实际上，根据Miller等人（非专利文献1）及Rubnitz等人（非专利文献2）的报告，在将癌症患者作为受体、并在将NK细胞浓缩了的基础上移植其近亲的健康者供体的新鲜外周血单核细胞时，被移植的NK细胞不会对受体引起副作用，而暂时地存活，并保持溶细胞活性。但是，尚未有显示出NK细胞的移植疗法有效性的临床治疗试验的报告。其理由之一在于，可从供体通过淋巴球血液成分单采而回收的细胞数量是有限的，因而在直到目标细胞灭绝为止的期间，无法使为使癌细胞及病原体感染细胞这样的目标细胞灭绝所需要的足够数量的NK细胞滞留在受体体内。由正常成人的外周血的1次血液成分单采可回收约1×10¹⁰个的单核细胞，如果将外周血单核细胞中的NK细胞的构成比率设为约7%，则可以得到7×10⁸个NK细胞（非专利文献3）。另一方面，NK细胞的移植中，使用1×10⁵个/kg至2×10⁷个/kg（非专利文献1）、或者5×10⁵个/kg至8.1×10⁷个/kg（非专利文献2）的数量级的NK细胞。如果将患者的体重设为60kg，则将需要6×10⁶个至4.8×10⁹个的NK细胞。这相当于由正常成人的外周血的1次血液成分单采而得到的NK细胞的0.0086倍至6.86倍。但是，例如根据非专利文献2，并未发现NK细胞的存活时间与给予的NK细胞的数量相关，在2天至189天内，存活时间的中间值仅为10天。由此，在直到目标细胞灭绝为止的期间，为了使为使癌细胞及病原体感染细胞这样的目标细胞灭绝所需要的足够数量的NK细胞滞留在受体体内，需要频繁地重复NK细胞的移植，这对患者而言将成为极大的负担。因此，正在推进使由供体得到的NK细胞先在试管内培养扩增，来得到为使目标细胞灭绝所需要的足够的NK细胞的技术的开发。Terunuma,H.等人（专利文献1）在对人CD3的激动剂抗体即OKT3、IL-2、抗CD16抗体的存在下，将健康者的外周血单核细胞培养13天，使NK细胞扩增至纯度81.2%、130倍。此外，所述NK细胞对K562细胞的溶细胞活性（E：T=3：1）为66%。Tanaka,J.等人（专利文献2）通过使用添加了IL-2、IL-15、抗CD3抗体、5%的人AB型血清、他克莫司（tacrolimus）及达肝素钠（dalteparin）的培养基的方法，将健康者的外周血单核细胞培养21天，使NK细胞扩增至纯度73.4%、6268倍。此外，所述NK细胞对K562细胞的溶细胞活性（E：T=1：1）约为55%。Carlens,S.等人（非专利文献4）报告了：在对人CD3的激动剂抗体即OKT3、IL-2的存在下，将健康者的外周血单核细胞培养21天，使NK细胞扩增至纯度55%、193倍。此外，所述NK细胞对K562细胞的溶细胞活性（E：T=1：1）为45%。Alici,E.等人（非专利文献5）报告了：在同样的条件下将骨髓瘤患者的外周血单核细胞培养20天，使NK细胞扩增至纯度65%、1625倍。此外，所述NK细胞对K562细胞的溶细胞活性（E：T=1：1）约为10%。Fujisaki,H.等人（非专利文献6）报告了：在使用白血病细胞作为饲养细胞的培养条件下，将健康者的外周血单核细胞培养21天，使NK细胞扩增至纯度96.8%、277倍，其中所述白血病细胞被进行了遗传性改变以表达使NK细胞活性化的因子。此外，所述NK细胞对K562细胞的溶细胞活性（E：T=1：1）的最大值约为90%。通过Terunuma,H.等人（专利文献1）、Tanaka,J.等人（专利文献2）、Carlens,S.等人（非专利文献4）及Alici,E.等人（非专利文献5）的方法而扩增的NK细胞的溶细胞活性（E：T=1：1）分别为66%、约55%、45%及约10%。因此，在以往技术中，NK细胞的溶细胞活性低，因此治疗效果低，NK细胞的施用数增大，因而并不优选。在Fujisaki,H.等人（非专利文献6）的方法中，扩增后的NK细胞的溶细胞活性约为90%（最大值）。但是，由于使用被遗传性改变了的肿瘤细胞作为饲养细胞，因此存在该细胞混入最终产物的风险，因而并不优选。现有技术文献专利文献专利文献1：日本特开2007-297291号公报专利文献2：日本特愿2011-140504号申请说明书非专利文献非专利文献1：Miller,J.S.等人，Blood，105：3051（2005）非专利文献2：Rubnitz,J.E.等人，J.Clin.Oncol.，28：955（2010）非专利文献3：Cho,D.及Campana,D.，Koreanxa0J.Lab.Med.，29：89（2009）非专利文献4：Carlens,S.等人，Hum.Immunol.，62：1092（2001）非专利文献5：Alici,E.等人，Blood、111：3155（2008）非专利文献6：Fujisaki,H.等人，Cancerxa0Res.，69：4010（2009）
发明内容
发明所要解决的课题因此，需要开发在不使用饲养细胞的情况下，由脐带血、或外周血都可以高纯度地扩增具有高溶细胞活性的NK细胞的技术。用于解决课题的方法本发明提供一种NK细胞的扩增方法。本发明的NK细胞的扩增方法包括：制备包含NK细胞的细胞群的步骤；从所述包含NK细胞的细胞群中将T细胞除去的步骤；和在包含2500IU/mL至2813IU/mL的IL-2的培养基中培养除去了所述T细胞后的剩余的细胞的步骤。在本发明的NK细胞的扩增方法中，有时从所述包含NK细胞的细胞群中将所述T细胞除去的步骤是通过将CD3阳性细胞除去的步骤来实现的。有时本发明的NK细胞的扩增方法包括从所述包含NK细胞的细胞群中将造血前体细胞除去的步骤。在本发明的NK细胞的扩增方法中，有时从所述包含NK细胞的细胞群中将所述造血前体细胞除去的步骤是通过将CD34阳性细胞除去的步骤来实现的。在本发明的NK细胞的扩增方法中，有时所述培养基包含自体血清、AB型血清和/或血清白蛋白。在本发明的NK细胞的扩增方法中，有时制备所述包含NK细胞的细胞群的步骤是通过从采集自受试者的血细胞中将单核细胞分离的步骤来实现的。在本发明的NK细胞的扩增方法中，有时所述血细胞采集自外周血、脐带血、骨髓和/或淋巴结。在本发明的NK细胞的扩增方法中，有时通过血液成分单采术从外周血采集所述血细胞。在本发明的NK细胞的扩增方法中，有时所述包含NK细胞的细胞群由选自源于干细胞的造血干细胞、源于脐带血的造血干细胞、源于外周血的造血干细胞、源于骨髓血的造血干细胞、脐带血单核细胞、和外周血单核细胞中的至少1种细胞来制备，其中所述干细胞为选自胚胎干细胞、成体干细胞及人工多能干（iPS）细胞中的任意一种。有时所述包含NK细胞的细胞群的供体源于：作为受体的患者自身、该患者的近亲、或者与患者无血缘关系的人。所述NK细胞有时源于受体的主要组织相容性抗原（MHC）、和杀伤细胞免疫球蛋白样受体（Killerxa0Immunoglobulin-likexa0Receptor：KIR）不一致的供体。本发明提供包含通过本发明的扩增方法而制备的NK细胞的、用于细胞疗法的医药组合物。本发明的医药组合物除了扩增后的NK细胞之外，有时还包含NK细胞前体、T细胞、NKT细胞、造血前体细胞等。有时本发明的医药组合物用于治疗传染病和/或癌症。本发明的医药组合物有时被施用于具有与通过本发明的扩增方法而制备的NK细胞不同的HLA基因型的患者。本发明提供一种细胞疗法，该细胞疗法包括：制备包含所述NK细胞的细胞群的步骤；从所述包含NK细胞的细胞群中将T细胞除去的步骤；在包含2500IU/mL至2813IU/mL的IL-2的培养基中培养除去了所述T细胞后的剩余的细胞的步骤；将由所述剩余的细胞扩增后的NK细胞移植给患者的步骤。有时所述细胞疗法包含：从所述包含NK细胞的细胞群中将造血前体细胞除去的步骤。在将所述NK细胞移植给患者的步骤中，扩增后的NK细胞有时与NK细胞前体、T细胞、NKT细胞、造血前体细胞等一起被移植。有时本发明的细胞疗法被用于治疗和/或预防传染病和/或癌症。有时本发明的细胞疗法包含：移植给具有与通过本发明的扩增方法而制备的NK细胞不同的HLA基因型的患者的步骤。在本发明的细胞疗法中，有时将所述NK细胞移植给患者的步骤通过将本发明的医药组合物施用于患者的步骤来实现。在本发明的细胞疗法中，有时所述包含NK细胞的细胞群由选自源于干细胞的造血干细胞、源于脐带血的造血干细胞、源于外周血的造血干细胞、源于骨髓血的造血干细胞、脐带血单核细胞、和外周血单核细胞中的至少1种细胞来制备，其中所述干细胞为选自胚胎干细胞、成体干细胞及人工多能干（iPS）细胞中的任意一种。有时所述包含NK细胞的细胞群的供体源于：作为受体的患者自身、该患者的近亲、或者与患者无血缘关系的人。有时所述NK细胞源自受体的主要组织相容性抗原（MHC）、和杀伤细胞免疫球蛋白样受体（Killerxa0Immunoglobulin-likexa0Receptor：KIR）不一致的供体。在本说明书中，“NK细胞”表示CD3阴性CD56阳性的单核细胞，尤其是对MHC类I型分子的表达少、或者该表达消失了的细胞具有溶细胞活性。在本发明的扩增方法中，所述包含NK细胞的细胞群可以使用本领域技术人员已知的各种步骤来制备。例如，可以在由脐带血及外周血这样的血液回收单核细胞时，使用密度梯度离心法。此外，NK细胞可以使用免疫磁珠来采集。而且，就所述NK细胞而言，可以使用对细胞表面标记特异性的抗体进行免疫荧光染色，使用FACS（Fluorescencexa0activatedxa0cellxa0sorter，荧光激活细胞分选仪）或流式细胞仪进行分离、鉴定。此外，所述NK细胞也可以如下制备：使用包括但不限于由Invitrogen公司市售的Dynal公司制的Dynabeads（商标）、Miltenyixa0Biotec公司的CliniMACS（商标）的免疫磁珠，将表达细胞表面抗原CD3和/或CD34的细胞分离除去来制备。此外，有时利用对T细胞和/或造血前体细胞的特异性结合配偶体，使T细胞和/或造血前体细胞选择性地受伤或灭绝。需要说明的是，将所述T细胞从所述单核细胞除去的步骤也可以是将其他的细胞类型、例如造血前体细胞、B细胞和/或NKT细胞与T细胞一起除去的步骤。将造血前体细胞从所述单核细胞除去的步骤也可以是将其他的细胞类型、例如T细胞、B细胞和/或NKT细胞与造血前体细胞一起除去的步骤。在本发明的扩增方法中，有时由脐带血及外周血分离的单核细胞被冷冻保存，并根据向患者的移植时间来解冻，供于NK细胞的扩增。或者，有时所述单核细胞在通过本发明的NK细胞的扩增方法扩增的途中、或在扩增结束后被冷冻，并根据向患者的移植时间来解冻，供于向患者的移植。血细胞的冷冻及解冻可以使用本领域技术人员公知的方法。有时在所述细胞的冷冻中，可以使用任意一种市售的细胞冷冻保存液。在本发明的细胞疗法中，就用于使活着的NK细胞悬浮的溶液而言，例如，通常有生理盐水、磷酸缓冲生理盐水（PBS）、培养基、血清等。有时所述溶液包含作为医药品及准医药品的药学上允许的载体。本发明的NK细胞疗法可以适用于NK细胞敏感的各种疾病的治疗和/或预防。所述疾病包括但不限于例如口腔癌、胆囊癌、胆管癌、肺癌、肝癌、大肠癌、肾癌、膀胱癌、白血病、或者由病毒、细菌等引起的传染病。有时本发明的细胞疗法可以通过单独或组合外科疗法、化学疗法、放射疗法等来实施。在本发明的细胞疗法中，有时NK细胞例如通过向静脉、动脉、皮下、腹腔内等施用来移植。用于制备本发明的NK细胞的细胞培养用培养基包括但并不限于KBM501培养基（Kohjinxa0Bio株式会社）、CellGroxa0SCGM培养基（CellGenix，岩井化学药品株式会社）、X-VIVO15培养基（Lonza，Takaraxa0Bio株式会社）、IMDM、MEM、DMEM、RPMI-1640等。所述培养基中，有时以能够实现本发明的目的的浓度来添加白介素-2（IL-2）。有时所述IL-2的浓度为2500IU/mL至2813IU/mL。所述IL-2优选具有人的氨基酸序列，从安全上考虑，优选通过重组DNA技术来生产。本说明书中，IL-2的浓度有时以日本标准单位（JRU）及国际单位（IU）来表示。由于1IU为约0.622JRU，因此1750JRU/mL为约2813IU/mL。所述培养基中，有时添加有受试者的自体血清、能够从BioWhittaker公司等获得的人AB型血清、能够从日本红十字会获得的献血人血清白蛋白。所述自体血清及所述人AB型血清优选以1至10%的浓度添加，所述献血人血清白蛋白优选以1至10%的浓度添加。有时所述受试者为健康者、和患有所述疾病的患者。所述培养基中，以不损害NK细胞的扩增效果为条件，有时含有适当的蛋白质、细胞因子、抗体、化合物等成分。所述细胞因子有时为白介素3（IL-3）、白介素7（IL-7）、白介素12（IL-12）、白介素-15（IL-15）、白介素-21（IL-21）、干细胞因子（SCF）、和/或FMS样酪氨酸激酶3配体（Flt3L）。所述IL-3、IL-7、IL-12、IL-15、IL-21、SCF及Flt3L优选具有人的氨基酸序列，从安全上考虑，优选通过重组DNA技术来生产。对于所述培养基的更换，以能够得到所期望的NK细胞的细胞数为条件，从培养开始后任意时刻进行均可，优选为每3-5日进行更换。在本发明的扩增方法中，培养容器包括但不限于商业上可获得的皿、烧瓶、板、多孔板。作为培养条件，只要不损害NK细胞的扩增效果，则没有特别限制，通常为37℃、5%CO₂及饱和水蒸气环境下的培养条件。由于本发明的目的为大量制备NK细胞，因此在所述培养基进行培养的时间越长，则越能够得到更多的NK细胞，因此是有利的。就培养时间而言，只要是能够将NK细胞扩增至所期望的细胞数的条件，则没有特别限制。在本发明的扩增方法中，有时所述包含NK细胞的细胞群除NK细胞外，还包含NK细胞前体、T细胞、NKT细胞、造血前体细胞等。有时所期望的NK细胞在扩增后，通过使用例如密度梯度离心法、免疫磁珠、FACS、流式细胞法等来进行选择。例如，有时所述NK细胞通过使用抗CD3抗体、抗CD16抗体、抗CD34抗体、抗CD56抗体、抗CD69抗体、抗CD94抗体、抗CD107a抗体、抗KIR3DL1抗体、抗KIR3DL2抗体、抗KIR2DL3抗体、抗KIR2DL1抗体、抗KIR2DS1抗体、抗KIR2DL5抗体、抗NKp46抗体、抗NKp30抗体、抗NKG2D抗体等，从所述细胞群选择性分离。有时所述抗体为单克隆抗体、多克隆抗体等。有时NK细胞的选择通过选择性除去T细胞、NKT细胞、造血前体细胞等细胞来进行。本发明的方法及医药组合物的制造优选在适合于医药品及准医药品的制造管理及品质管理规则的条件（goodxa0manufacturingxa0practice、GMP）下来实施。扩增后的NK细胞的溶细胞活性可以通过本领域技术人员公知的方法来评价。所述溶细胞活性一般通过如下方法进行定量：孵育所述NK细胞（效应细胞）、和使用放射性物质、荧光色素等标记后的目标细胞后，对放射量或荧光强度进行测定。有时所述目标细胞为K562细胞、急性骨髓性白血病细胞、慢性骨髓性白血病细胞，但并不限定于此。有时扩增后的NK细胞的性质使用RT-PCR法、固相杂交形成法、ELISA法、蛋白质印迹法、免疫沉降法、免疫比浊法、FACS、流式细胞法等来进行调查。在本发明中，脐带血及外周血的全血的采集、自体血清的制备、来自所述全血的单核细胞的制备、该单核细胞的培养前后的细胞数的测定、培养前后的所述单核细胞中的NK细胞、T细胞、造血前体细胞等细胞类型的构成比率的测定、NK细胞的扩增倍率的计算、和关于测定误差和显著性的统计分析可以使用本领域技术人员公知的任意方法来实施。本说明书中提到的全部文献通过引用其整体而包含在本说明书中。
附图说明
图1A为在除去CD3阳性细胞之前，使用对CD3及CD56的抗体进行双重染色并通过流式细胞法进行测定的结果图。图1B为在除去CD3阳性细胞之后，使用对CD3及CD56的抗体进行双重染色并通过流式细胞法进行测定的结果图。图2A为从5名健康人的外周血中的单核细胞分离出的CD3阴性细胞的细胞数的各自的增殖曲线。图2B为从5名健康人的外周血中的单核细胞分离出的CD3阴性细胞的细胞数的平均增殖曲线。图3A为从5名健康人的外周血中的单核细胞分离出的CD3阴性细胞的扩增倍率的各自的增殖曲线。图3B为从5名健康人的外周血中的单核细胞分离出的CD3阴性细胞的扩增倍率的平均增殖曲线。图4A为从5名健康人的外周血中的单核细胞分离出的NK细胞（CD3阴性/CD56阳性）的扩增倍率的各自的增殖曲线。图4B为从5名健康人的外周血中的单核细胞分离出的NK细胞（CD3阴性/CD56阳性）的扩增倍率的平均增殖曲线。图5A为通过流式细胞法对从5名健康人分离出的NK细胞（CD3阴性/CD56阳性）相对于培养细胞总体的构成比率的经时变化进行测定的结果图。图5B为通过流式细胞法对从5名健康人分离出的NK细胞（CD3阴性/CD56阳性）相对于培养细胞总体的构成比率的经时变化进行测定、并平均化的结果图。图6A为通过流式细胞法对从3名晚期癌症（口腔癌、胆嚢癌及胆管癌）的患者分离出的NK细胞（CD3阴性/CD56阳性）相对于培养细胞总体的构成比率的经时变化进行测定的结果图。图6B为从3名晚期癌症（口腔癌、胆嚢癌及胆管癌）的患者分离出的NK细胞（CD3阴性/CD56阳性）的扩增倍率的平均增殖曲线。图7为对CD69的流式细胞仪分析结果进行比较的图表。图8为对CD69的流式细胞仪分析结果进行比较的平均荧光强度（MFI）的测定值的图表。图9为对CD16的流式细胞仪分析结果进行比较的图表。图10为对CD16的流式细胞仪分析结果进行比较的平均荧光强度（MFI）的测定值的图表。图11为对各种细胞表面标记的流式细胞仪分析结果进行比较的图表。图12为在KBM培养基、和CellGro培养基中培养出的NK细胞的扩增倍率的增殖曲线。图13为表示对通过本发明的方法扩增后的源于外周血的NK细胞对K562的溶细胞活性进行调查的实验结果的图表。图14为通过流式细胞法对从健康人分离出的CD107a阳性细胞相对于培养细胞总体的构成比率的经时变化进行测定的结果图。图15为表示除去1次及2次CD3阳性细胞后的NK细胞（CD3阴性/CD56阳性）相对于培养细胞总体的构成比率的柱状图。图16A为表示扩增前的CD3阴性细胞、和CD3及CD34阴性细胞中的CD34阳性细胞的构成比率的柱状图。图16B为表示扩增前的CD3阴性细胞、和CD3及CD34阴性细胞中的CD3阳性细胞的构成比率的柱状图。图17为表示扩增后的CD3阴性细胞、和CD3及CD34阴性细胞中的NK细胞（CD3阴性/CD56阳性）相对于培养细胞总体的构成比率的柱状图。
具体实施方式
就以下说明的本发明的实施例而言，其目的仅为例示，而并非对本发明的技术范围进行限定。本发明的技术范围仅受权利要求的记载的限定。在不脱离本发明的主旨的条件下，可以进行本发明的变更、例如进行本发明的构成要件的追加、删除及置换。实施例1NK细胞的扩增（1）1.材料及方法（1）自外周血的采血外周血采集自健康人、和晚期癌症（口腔癌、胆嚢癌及胆管癌）的患者。本实验获得了九州大学医系地区部局临床研究伦理审查委员会的批准（批准号22-176，批准日：平成23年3月31日）而实施。自所述健康人及所述患者获得书面同意。采血、冷冻保存、及解冻通过本领域技术人员公知的方法来进行。（2）自外周血分离单核细胞将所得的血液用保存于常温的稀释液（添加有1mMxa0EDTA及2%胎牛血清的PBS）稀释2倍，在各离心管中，20～35mL稀释血由10～15mL的Ficollxa0Paque（比重1.077）覆盖。离心在500×g、室温下进行20分钟，不经制动地停止离心。以剩余数mL的方式除去离心上清（血浆部分），回收中间层。将回收自1～2根离心管的所述中间层收集到1根新的离心管中，用所述稀释液调节体积至50mL。第二次离心在500×g、室温、5分钟或15分钟的条件下进行。除去上清，使团粒悬浮于30mL的所述稀释液中。第三次离心在280×g、室温、10分钟的条件下进行。除去上清，以使细胞浓度为1×10⁷个/mL的方式使沉淀物悬浮于添加有2mMxa0EDTA和0.1%BSA的PBS中（以下称为“单核细胞悬浮液”）。（3）CD3阳性细胞的除去抗CD3抗体被固定化后的磁珠（Dynabeadsxa0CD3）用添加有0.1%BSA的PBS洗涤1次后，以每10⁷个细胞添加50μL的方式被添加到所述单核细胞悬浮液中。在4℃下使用旋转器将所述包含磁珠的单核细胞悬浮液搅拌30分钟。之后，通过磁铁将所述磁珠从所述悬浮液中分离，除去在细胞表面表达CD3的细胞（CD3阳性细胞）。（4）除去CD3阳性细胞后的细胞群的培养所述悬浮液中的剩余细胞（以下，称为“CD3阴性细胞”。）使用添加有5%自体血清的细胞培养用培养基（KBM501，16025015，Kohjinxa0Bio株式会社；含有1750JRU/mL的IL-2）（以下，称为“KBM培养基”。）进行稀释以达到5×10⁵个/mL，并接种于6孔培养板（140675，nunc，Thermoxa0Fisherxa0Scientific株式会社）。在37℃、5%CO₂及饱和水蒸气环境下进行21天细胞培养。在培养第5天、第9天、第13天及第17天进行培养基更换。所述细胞在无饲养细胞的条件下进行培养。（5）细胞数及细胞表面标记的分析所述外周血单核细胞的细胞数通过在培养开始时至第21天为止的期间使用血球计对活细胞数进行计量来确定。使用抗CD3抗体（317308，BioLegendxa0Japan株式会社）、抗CD16抗体（556618，BDxa0Pharmingen，日本Bectonxa0Dickinson株式会社）、抗CD56抗体（304607，318321，BioLegendxa0Japan株式会社）、抗CD69抗体（310905BioLegendxa0Japan株式会社）、抗KIR3DL1/KIR3DL2抗体（130-095-205，Miltenyixa0Biotec株式会社）、抗KIR2DL3抗体（FAB2014P，R＆Dxa0SYSTEMS公司，COSMOxa0BIO株式会社）、抗KIR2DL1/KIR2DS1抗体（339505，BioLegendxa0Japan株式会社）、抗KIR2DL5抗体（341303，BioLegendxa0Japan株式会社）、抗NKp46抗体（331907，BioLegendxa0Japan株式会社）、抗NKp30抗体（325207，BioLegendxa0Japan株式会社）、及抗NKG2D抗体（320805，BioLegendxa0Japan株式会社）通过流式细胞法来分析所述细胞的细胞表面标记。2.结果（1）健康人的NK细胞的扩增图1A为在除去CD3阳性细胞之前，使用对CD3及CD56的抗体进行双重染色，并通过流式细胞法进行测定的实验结果。图1B为在除去CD3阳性细胞之后，使用对CD3及CD56的抗体进行双重染色并通过流式细胞法进行测定的实验结果。就“CD3阳性细胞的构成比率”而言，通过流式细胞法计量出的、各实验组的全部培养细胞中的CD3阳性细胞的比例以百分率表示。CD3阳性细胞的构成比率（%）在除去CD3阳性细胞前为69.37%，在除去CD3阳性细胞后为0.68%。由上述结果可知：CD3阳性细胞从单核细胞悬浮液中被显著地除去。图2A为从5名健康人的外周血中的单核细胞分离出的CD3阴性细胞的细胞数的各自的增殖曲线。图2B为从5名健康人的外周血中的单核细胞分离出的CD3阴性细胞的细胞数的平均增殖曲线。在培养开始时、培养5天后、培养9天后、培养13天后、培养17天后及培养21天后，对从5名健康人采集到的每1mL外周血的CD3阴性细胞的细胞数进行测定。各实验条件的标准偏差由在同一条件下重复5次的实验结果的测定值算出。CD3阴性细胞从培养开始时起到第21天后为止持续增加。增加速度到第13天为止持续上升，在第13天后降低。CD3阴性细胞从培养开始时的约5×10⁵个增加至培养21天后的约700×10⁵个。图3A为从5名健康人的外周血中的单核细胞分离出的CD3阴性细胞的扩增倍率的各自的增殖曲线。图3B为从5名健康人的外周血中的单核细胞分离出的CD3阴性细胞的扩增倍率的平均增殖曲线。所述扩增倍率以用培养5天后、培养9天后、培养13天后、培养17天后及培养21天后的CD3阴性细胞的细胞数除以培养开始时的CD3阴性细胞的细胞数所得的商的形式算出。各实验条件的标准偏差由在同一条件下重复5次的实验结果的测定值算出。CD3阴性细胞的扩增倍率从培养开始时起到第21天为止持续增大。所述扩增倍率到第13天为止显著持续增大，在培养21天后增大至约150倍。图4A为从5名健康人的外周血中的单核细胞分离出的NK细胞（CD3阴性/CD56阳性）的扩增倍率的各自的增殖曲线。图4B为从5名健康人的外周血中的单核细胞分离出的NK细胞（CD3阴性/CD56阳性）的扩增倍率的平均增殖曲线。在图4A及图4B中，使用对CD3及CD56的抗体进行双重染色并通过流式细胞法对CD3阴性细胞进行分析。所述扩增倍率以用培养7天后、培养14天后及培养21天后的NK细胞的细胞数除以培养开始时的NK细胞的细胞数所得的商的形式算出。各实验条件的标准偏差由在同一条件下重复5次的实验结果的测定值算出。NK细胞的扩增倍率从培养开始时起到第21天为止持续增大。所述扩增倍率到第14天为止显著持续增大，在培养21天后增大至约400倍。图5A为通过流式细胞法对从5名健康人分离出的NK细胞（CD3阴性/CD56阳性）相对于培养细胞总体的构成比率的经时变化进行测定的实验结果。图5B为通过流式细胞法对从5名健康人分离出的NK细胞（CD3阴性/CD56阳性）相对于培养细胞总体的构成比率的平均值的经时变化进行测定、并平均化的实验结果。在图5A及图5B中，使用对CD3及CD56的抗体进行双重染色并通过流式细胞法对CD3阴性细胞进行分析。就“NK细胞的构成比率”而言，通过流式细胞法进行计量的、各实验组的全部培养细胞中的NK细胞的比例以百分率表示。图表的纵轴为NK细胞（CD3阴性/CD56阳性）相对于培养细胞总体的构成比率（%），横轴为培养天数。各实验条件的标准偏差由在同一条件下重复5次的实验结果的测定值算出。NK细胞的构成比率从培养开始时起到第21天为止持续增大。所述NK细胞的构成比率到第14天为止显著持续增大，在培养14天后增大至约90。本发明示出可选择性地且经时地使NK细胞扩增。（2）患者的NK细胞的扩增图6A为通过流式细胞法对从3名晚期癌症（口腔癌、胆嚢癌及胆管癌）的患者分离出的NK细胞（CD3阴性/CD56阳性）相对于培养细胞总体的构成比率的经时变化进行测定的实验结果。图6B为从3名晚期癌症（口腔癌、胆嚢癌及胆管癌）的患者分离出的NK细胞（CD3阴性/CD56阳性）的扩增倍率的平均增殖曲线。就“NK细胞的构成比率”而言，通过流式细胞法计量的、各实验组的全部培养细胞中的NK细胞的比例以百分率表示。在图6A的图表中，纵轴为NK细胞（CD3阴性/CD56阳性）相对于培养细胞总体的构成比率（%），横轴为培养天数。就“NK细胞的扩增倍率”而言，其表示为用扩增后的NK细胞的细胞数除以扩增前外周血单核细胞中所存在的NK细胞的细胞数而得的结果。在图6B的图表中，纵轴为NK细胞的扩增倍率，横轴为培养天数。各实验条件的标准偏差由在同一条件下重复3次的实验结果的测定值算出。如图6A所示，NK细胞的构成比率从培养开始时起到第14天为止显著持续增加，在培养14天后增大至约85%。此外，如图6B所示，NK细胞的扩增倍率从培养开始时起到第14天为止显著持续增加，在培养14天后增大至约140倍。在培养21天后，CD3阳性细胞发生了增殖，因此NK细胞的构成比率降低。但是，所述CD3阳性细胞的增殖几乎没有给NK细胞的扩增带来影响。由以上的结果显示出：从晚期癌症（口腔癌、胆嚢癌及胆管癌）的患者分离出的NK细胞可经时扩增。此外，本发明显示出：可以使从患有癌症、传染病等的患者分离出的NK细胞经时扩增。（3）NK细胞的分化标记的表达图7、9及11中示出了对各细胞表面标记的流式细胞仪分析结果进行比较的图表。此外，图8及10中示出了对CD69及CD16的流式细胞仪分析结果进行比较的平均荧光强度（MFI）的测定值的图表。各实验条件的标准偏差由在同一条件下重复3次的实验结果的测定值算出。由图7至图11可知：与扩增前的细胞相比较，通过本发明的方法扩增的细胞强势地表达出CD69、KIR2DL3、KIR2DL1/KIR2DS1、KIR2DL5、NKp30、及NKG2D。尤其是，在所述扩增后的细胞中，CD69的表达约为100%。这些图显示出：通过本发明的方法制备出的细胞可对作为NK细胞的分化标记进行表达。此外示出，所述NK细胞具备高溶细胞活性。本实施例的实验结果显示出：将CD3阳性细胞、即T细胞除去后，在所述KBM培养基中进行培养，由此基本可以仅使NK细胞选择性地且有效地进行扩增。显示出：不仅可以由健康人、而且可以由患有癌症、传染病等的患者制备大量的NK细胞。此外显示出：本发明的方法不仅可以使源于外周血的NK细胞显著地扩增，而且可以使源于其他的组织、器官的细胞、特别是源于脐带血的NK细胞显著地扩增。实施例2NK细胞的扩增（2）1.材料及方法NK细胞根据实施例1中说明的方法由健康人制备。制备添加了2500IU/mL的IL-2（AF-200-02-2，PeproTech，东洋纺织株式会社）、和5%自体血清的CellGroxa0SCGM（2001，CellGenix，岩井化学药品株式会社）（以下，称为“CellGro培养基”。）作为细胞培养用培养基。所述NK细胞按照实施例1中说明的方法在所述KBM培养基及所述CellGro培养基中进行扩增。2.结果图12为在KBM培养基、和CellGro培养基中培养出的NK细胞的扩增倍率的增殖曲线。所述扩增倍率以用培养7天后、培养14天后及培养21天后的NK细胞的细胞数除以培养开始时的NK细胞的细胞数所得的商的形式算出。各实验条件的标准偏差由在同一条件下重复2次的实验结果的测定值算出。NK细胞的扩增倍率在KBM培养基及CellGro培养基中，从培养开始时起到第21天为止持续增大。在培养21天后，所述扩增倍率在KBM培养基中为约670倍，在CellGro培养基约为140倍。本实施例的实验结果显示出：NK细胞在所述KBM培养基、和所述CellGro培养基中充分地进行扩增。因此，显示出：NK细胞与细胞培养用培养基的类型无关，可以在包含2500IU/mL至2813IU/mL的IL-2的培养基中进行扩增。实施例3扩增后的NK细胞的溶细胞活性1.材料及方法（1）溶细胞活性的定量NK细胞按照实施例1中说明的方法来制备，并作为效应细胞来使用。通过本领域技术人员公知的方法制备K562细胞（慢性骨髓性白血病细胞），并作为目标细胞来使用。扩增后的NK细胞、和未扩增的NK细胞（以下，称为“非扩增NK细胞”。）的溶细胞活性通过本领域技术人员公知的方法来定量。简单而言，所述目标细胞在添加了3,3’-二（十八烷基）氧杂羰花青（3,3’-dioctadecyloxacarbocyanine）（D4292，Sigma-Aldrichxa0Japan株式会社）（终浓度：0.01mM）的RPMI-1640培养基中培养10分钟，由此进行标识。所述目标细胞在标识后使用PBS（-）及无血清IMDM培养基洗涤3次。所述效应细胞和所述目标细胞被接种于圆底的96孔的培养板中，在无血清IMDM培养基中共培养2小时。就效应细胞和目标细胞之比（E：T比）而言，以3：1、2：1、1：1、1：5、及1：10的方式来制备。使用抗MHC类I抗体（311409，BioLegendxa0Japan株式会社）及7-氨基-放线菌素D（A9400，Sigma-Aldrichxa0Japan株式会社）通过流式细胞法对溶细胞活性（%）进行定量。（2）NK细胞的分化标记的表达NK细胞按照实施例1中说明的方法进行扩增。在培养开始时、培养3天后、培养7天后、培养14天后及培养21天后，以2：1的E：T比将所述NK细胞和所述K562细胞共培养2小时。之后，所述NK细胞中的CD107a阳性细胞的构成比率使用抗CD107a抗体（328606，BioLegendxa0Japan株式会社）通过流式细胞法来分析。2.结果（1）溶细胞活性的定量图13为表示对通过本发明的方法扩增后的源于外周血的NK细胞对K562的溶细胞活性进行调查的实验结果的图表。纵轴为溶细胞活性（单位：%）。白色柱表示非扩增NK细胞的溶细胞活性，黑色柱表示扩增后的NK细胞的溶细胞活性。横轴为扩增后的NK细胞或非扩增NK细胞、与K562细胞的E：T比。当E：T比为3：1时，就所述溶细胞活性而言，非扩增NK细胞约为30%，扩增后的NK细胞约为110%。当E：T比为2：1时，就所述溶细胞活性而言，非扩增NK细胞约为20%，扩增后的NK细胞约为107%。当E：T比为1：1时，就所述溶细胞活性而言，非扩增NK细胞约为10%，扩增后的NK细胞约为100%。当E：T比为1：5及1：10时，扩增后的NK细胞的所述溶细胞活性分别为约25%及约15%。（2）NK细胞的分化标记的表达图14为通过流式细胞法对从健康人分离出的CD107a阳性细胞相对于培养细胞总体的构成比率的经时变化进行测定的实验结果。各实验条件的标准偏差由在同一条件下重复5次的实验结果的测定值算出。就“CD107a阳性细胞的构成比率”而言，通过流式细胞法计量的、各实验组的全部培养细胞中的CD107a阳性细胞的比例以百分率表示。在图14的图表中，纵轴为CD107a阳性细胞相对于培养细胞总体的构成比率（%），横轴为培养天数。CD107a阳性细胞的构成比率从培养开始时起到第3天为止增大至约35%，所述构成比率在第21天仍得以维持。本实施例的实验结果显示出：通过本发明扩增后的NK细胞具有高溶细胞活性。因此，就本发明而言，其显示出：不使用饲养细胞、将外来分子转染后的NK细胞等，也可选择性地且有效地扩增溶细胞活性高的NK细胞。此外，就NK细胞而言，其不仅在由源于外周血的细胞进行扩增，即使在由源于其他的组织、器官的细胞、特别是源于脐带血的细胞来进行扩增时，也显示出高溶细胞活性。实施例4NK细胞的扩增（3）（CD3阳性细胞的重复除去）在实施例1至3的实验后，在进一步重复NK细胞的扩增实验中，发现如下情况：CD3阳性细胞非选择性地增大，CD3阳性细胞相对于培养细胞总体的构成比率如本实施例的结果所示而有时超过30%。在利用通过血液成分单采术从晚期癌症患者采集的外周血单核细胞来扩增NK细胞的实验中，该CD3阳性细胞的非选择性地增大的频率约为30%（未示出数据。）。因此，为了选择性地扩增NK细胞，而尝试重复除去CD3阳性细胞的步骤。1.材料及方法按照实施例1中说明的方法，扩增NK细胞，对细胞数及细胞表面标记进行分析。单核细胞悬浮液由晚期癌症（口腔癌、胆嚢癌及胆管癌）的患者制备。实施1次或2次CD3阳性细胞的除去。CD3阴性细胞在所述KBM培养基中培养14天。2.结果图15为表示除去1次及2次CD3阳性细胞后的NK细胞（CD3阴性/CD56阳性）相对于培养细胞总体的构成比率的柱状图。各实验条件的误差柱表示在同一条件下重复3次的实验结果的测定值的标准误差。就NK细胞、CD3阳性细胞及其他细胞的构成比率而言，通过流式细胞法计量的、各实验组的全部培养细胞中的NK细胞、CD3阳性细胞及其他细胞的比例分别以百分率表示。图表的纵轴为NK细胞、CD3阳性细胞及其他细胞相对于培养细胞总体的构成比率（%），横轴为CD3阳性细胞的除去次数。就NK细胞相对于培养细胞总体的构成比率（%）而言，在CD3阳性细胞的1次除去的情况下约为50%，在CD3阳性细胞的2次除去的情况下约为65%。本实施例的实验结果显示出：CD3阳性细胞的重复除去使CD3阳性细胞相对于培养细胞总体的构成比率降低，可以增大NK细胞相对于培养细胞总体的构成比率。但是，对于使NK细胞选择性地扩增而言，所述CD3阳性细胞的重复除去的作用并不充分。因此，尝试并用所述CD3阳性细胞的重复除去以外的其他处理。实施例5NK细胞的扩增（4）（CD3阳性细胞及CD34阳性细胞的除去）1.材料及方法按照实施例1中说明的方法，扩增NK细胞，对细胞数及细胞表面标记进行分析。单核细胞悬浮液由晚期癌症（口腔癌、胆嚢癌及胆管癌）的患者制备。在除去CD3阳性细胞后，除去造血前体细胞。使用生物素化抗CD34抗体（343523，BioLegendxa0Japan株式会社）、和磁珠（Dynabeadsxa0biotinxa0binder，110-47，Lifexa0Technologiesxa0Japan株式会社），除去使CD34在细胞表面表达的细胞（CD34阳性细胞），由此进行所述造血前体细胞的除去。简单而言，使所述CD34阳性细胞、与所述生物素化抗CD34抗体反应。之后，进行离心分离，除去上清，制备出结合有所述抗体的细胞的悬浮液。所述磁珠使用添加有0.1%BSA的PBS洗涤1次后，以每10⁷个细胞添加50μL的方式被添加到所述悬浮液中。在4℃下使用旋转器将包含所述磁珠的悬浮液搅拌30分钟。通过磁铁将所述磁珠从所述悬浮液中分离，除去CD34阳性细胞。所述悬浮液中的剩余细胞（以下，称为“CD3及CD34阴性细胞”。）在所述KBM培养基中培养14天。在利用流式细胞法的计量中，追加使用抗CD34抗体（343505，BioLegendxa0Japan株式会社）。2.结果图16A为表示扩增前的CD3阴性细胞、和CD3及CD34阴性细胞中的CD34阳性细胞的构成比率的柱状图。图16B为表示扩增前的CD3阴性细胞、和CD3及CD34阴性细胞中的CD3阳性细胞的构成比率的柱状图。各实验条件的误差柱表示在同一条件下重复3次的实验结果的测定值的标准误差。就CD34阳性细胞及CD3阳性细胞的构成比率而言，通过流式细胞法计量的、各实验组的全部细胞中的CD34阳性细胞及CD3阳性细胞的比例以百分率来表示。图表的纵轴为扩增前的CD34阳性细胞及CD3阳性细胞相对于细胞总体的构成比率（%）。图表的横轴表示扩增用的各实验组的细胞类型。就扩增前的CD34阳性细胞的构成比率（%）而言，在CD3阴性细胞中约为0.15%，其在CD3及CD34阴性细胞中约为0.02%。就扩增前的CD3阳性细胞的构成比率（%）而言，其在CD3阴性细胞中约为0.15%，在CD3及CD34阴性细胞中约为0.25%。图17为表示扩增后的CD3阴性细胞、和CD3及CD34阴性细胞中的NK细胞（CD3阴性/CD56阳性）相对于培养细胞总体的构成比率的柱状图。各实验条件的误差柱表示在同一条件下重复3次的实验结果的测定值的标准误差。就NK细胞、CD3阳性细胞及其他细胞的构成比率而言，通过流式细胞法计量的、各实验组的全部培养细胞中的NK细胞、CD3阳性细胞及其他细胞的比例分别以百分率表示。图表的纵轴为NK细胞、CD3阳性细胞及其他细胞相对于培养细胞总体的构成比率（%）。图表的横轴表示扩增所使用的各实验组的细胞类型。就扩增后的NK细胞相对于培养细胞总体的构成比率（%）而言，其在CD3阴性细胞中约为60%，其在CD3及CD34阴性细胞中约为90%。本实施例的实验结果显示出：NK细胞（CD3阴性/CD56阳性）相对于培养细胞总体的构成比率，因除去CD3阳性细胞及CD34阳性细胞而显著地增大。此外，即使在利用通过血液成分单采术采集的外周血单核细胞来扩增NK细胞时，也显示出通过将CD3阳性细胞及CD34阳性细胞除去，能够以高纯度扩增NK细胞。结论由以上的实验结果可知，通过从源于外周血的单核细胞除去CD3阳性细胞（T细胞），能够大量制备NK细胞。而且，由本实施例的实验结果可知，通过本发明的方法扩增后的细胞具有非常高的溶细胞活性。而且，通过从源于外周血的单核细胞除去CD3阳性细胞（T细胞）及CD34阳性细胞（造血前体细胞），能够以高纯度地制备NK细胞。已知就目前报道的NK细胞的扩增方法而言，NK细胞的溶细胞活性低。例如，就源于健康人的外周血的NK细胞而言，Terunuma,H.等人的NK细胞的扩增成绩为：纯度为81.2%，扩增倍率为130倍，溶细胞活性为66%（E：T=3：1）（专利文献1）。就源于健康人的外周血单核细胞而言，Tanaka,J.等人的NK细胞的扩增成绩为：纯度为73.4%，扩增倍率为6268倍，溶细胞活性约为55%（E：T=1：1）（专利文献2）。就源于骨髓瘤患者的外周血的NK细胞而言，Carlens,S.等人的NK细胞的扩增成绩为：纯度为55%，扩增倍率为193倍，溶细胞活性为45%（E：T=1：1）（非专利文献4）。就源于骨髓瘤患者的外周血的NK细胞而言，Alici,E.等人的NK细胞的扩增成绩为：纯度为65%，扩增倍率为1625倍，溶细胞活性约为10%（E：T=1：1）（非专利文献5）。就源于健康人的外周血的NK细胞而言，Fujisaki,H.等人的NK细胞的扩增成绩为：当使用被进行了遗传性改变的肿瘤细胞作为饲养细胞时，纯度为96.8%，扩增倍率为277倍，溶细胞活性的最大值约为90%（E：T=1：1）（非专利文献6）。与此相对，就源于健康人的外周血的NK细胞而言，本发明的NK细胞的扩增成绩为：纯度约为90%，扩增倍率为400倍，溶细胞活性约为100%（E：T=1：1）。在以往技术中，就NK细胞对K562细胞的溶细胞活性而言，当使用被进行了遗传性改变的肿瘤细胞作为饲养细胞时，最大值约为约90%（E：T=1：1），当不使用饲养细胞时，为66%（E：T=3：1）。但是，本发明的NK细胞未使用饲养细胞进行扩增，对K562细胞的溶细胞活性约为100%（E：T=1：1）。因此，就本发明而言，NK细胞的溶细胞活性高、且不存在饲养细胞混入最终产物的风险，因此与现有技术相比而显著优异。因此，本发明对于由采集的血细胞以高纯度大量制备具有高溶细胞活性的NK细胞而言是有用的。